martedì 22 giugno 2010

Alte dosi di FSH aumentano il tasso di alterazioni cromosomiche degli ovociti maturati in vitro

1. Il caso: le alterazioni cromosomiche degli ovociti sono materia di grande interesse. Alcuni lavori correlano l'uso dell'FSH per la stimolazione ovarica con un aumento di queste alterazioni, ma la genesi di questo fenomeno non è nota. Nel caso della maturazione in vitro degli ovociti (IVM), l'FSH viene solitamente aggiunto ai mezzi di coltura.
2. Lo studio: questo lavoro, appena apparso su Fertility and Sterility, indaga in maniera prospettica l'effetto che l'FSH ha sugli ovociti immaturi coltivati in vitro.
3. Metodo: patient(s): 252 ovociti immaturi. Intervention(s): stimolazione ovarica con agonista ed FSH. Gli ovociti immaturi (stadio di vescicola germinale o metafase I) sono stati distribuiti in 5 diversi mezzi di coltura con dosi crescenti di FSH (0; 5,5; 22; 100 and 2000 ng/mL). Comparison(s): osservazione del fuso meiotico con luce polarizzata, analisi genetica con ibridazione fluorescente in situ (FISH). Outcome(s): l'effetto di varie dosi di FSH sul tasso di aneuploidie di ovociti coltivati in vitro.
4. Risultati: la proporzione di ovociti aneuploidi aumenta in maniera dose-dipendente con l'incremento delle dosi di FSH in coltura. Infatti il tasso di aneuploidie è rispettivamente 26,7%; 23,3%; 36,75%; 46,7% e 63,3% per i livelli di FSH di 0; 5,5; 22; 100 e 2000 ng/mL. Alti livelli di FSH incrementano quindi gli errori durante la meiosi degli ovociti immaturi.

venerdì 18 giugno 2010

Il valore dello spermiogramma nelle coppie subfertili

1. Caso: la valutazione del liquido seminale secondo la classificazione fornita dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), non permette di definire la fertilità di un individuo né di distinguere, all’interno di una popolazione subfertile, gli uomini in grado di ottenere spontaneamente un concepimento.
2. Lo studio: è uno studio pubblicato su Fertility and Sterility, osservazionale prospettico multicentrico, che valuta la capacità di concepimento spontaneo entro 12 mesi, di una popolazione subfertile cui viene effettuato inizialmente uno spermiogramma di controllo. Lo studio ha lo scopo di individuare una funzione matematica che riesca ad esprimere la probabilità di ottenere un concepimento spontaneo sulla base delle caratteristiche principali del liquido seminale (concentrazione, motilità, morfologia e volume).
3. Metodi: Patient(s): 3345 coppie subfertili. Intervention(s): analisi del liquido seminale secondo l’OMS. Valutazione della riserva ovarica, della pervietà tubarica e della presenza di endometriosi della partner femminile. Indirizzamento delle coppie (secondo un modello prognostico precedentemente sviluppato basato su fattori femminili e maschili) verso a) un trattamento di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) in caso di cattiva prognosi b) nessun trattamento in caso di buona prognosi. Comparison(s): osservazione delle coppie non indirizzate a trattamento o indirizzate (fino al momento in cui il trattamento inizia) e registrazione delle gravidanze cliniche spontanee ottenute. Outcome(s): una funzione in grado di esprimere la probabilità di concepimento spontaneo in base alle caratteristiche del liquido seminale
4. Risultati:
a) Il 21% delle coppie in osservazione ha ottenuto una gravidanza clinica spontanea.
b) Dei 3345 campioni di liquido seminale, il 41% rientra nella classificazione di normozoospermia secondo l’OMS ed il 59% risulta patologico per uno o più parametri. Il 24% delle coppie con normozoospermia ha ottenuto una gravidanza clinica spontanea contro un 23% di coppie con liquido seminale patologico. Nell’osservazione delle varie alterazioni del liquido seminale, solo una severa oligoastenoteratozoospermia è risultata significativamente meno rappresentata nelle coppie in gravidanza (12%) rispetto alla condizione di normozoospermia.
c) Secondo l’analisi dei dati in questo studio le possibilità di concepimento diminuiscono per:
concentrazione <40 milioni di spermatozoi per mL;
morfologia <20%;
numero totale di spermatozoi <200 milioni.
d) L’analisi multivariata delle caratteristiche del liquido seminale, sulla base di questi risultati, riesce ad indicare ad un individuo subfertile una probabilità di concepimento spontaneo entro 12 mesi che va dal 7% al 41%.
5. Conclusioni: lo studio dimostra che la classificazione secondo l’OMS non è informativa circa la probabilità di concepimento di una popolazione subfertile. L’approccio proposto da questo studio, in cui volume, concentrazione, motilità e morfologia vengono valutati insieme sulla base di un modello matematico, riesce a fornire maggiori informazioni sulla capacità di concepimento spontaneo di un uomo con determinati parametri seminali. L’informazione ottenuta resta limitata alla variabilità del liquido seminale di ogni soggetto e, nella ricerca di un figlio, alle caratteristiche della partner femminile. Tuttavia questo studio getta le basi per una valutazione dello spermiogramma diversa dalla normale classificazione normale/patologico che può risultare maggiormente informativa per la coppia ed il clinico.

giovedì 17 giugno 2010

Uso della FISH in maschi infertili: indicazioni e rilevanza clinica

Il caso: diversi lavori scientifici hanno riportato una correlazione fra alterato spermiogramma e un alto numero di anomalie cromosomiche degli spermatozoi. Quali pazienti possono beneficiare di una tecnica, l’ibridazione fluorescente in situ (FISH) del seme, per visualizzare le eventuali anomalie cromosomiche?

Lo studio: è uno studio retrospettivo di analisi FISH e pubblicato su Fertility and Sterility.

Quesito dello studio: scopo del lavoro è di determinare quei pazienti nei quali una FISH degli spermatozoi potrebbe essere indicata, il numero e quali cromosomi analizzare per avere il r risultato in termini di tempo, costi e informazioni ottenute e infine dare una interpretazione dei risultati ottenuti di rilevanza clinica.

Metodi: Patient(s): 319 pazienti infertili a consulto per riproduzione assistita con età media 36±5. Intervention(s): FISH dei campioni di seme. Outcome(s): frequenze di anomalie nei cromosomi 13, 18, 21, X e Y comparate allo spermiogramma, al cariotipo somatico e meiotico (sulle varie fasi della spermatogenesi) e all’età.

Risultati: i pazienti riscontrati con la percentuale più alta di anomalie cromosomiche degli spermatozoi erano oligozoospermici (50%), oligoastenozoospermici (33.3%) e oligoastenoteratozoospermici (21%). Dei parametri seminali analizzati (conta, motilità e morfologia) solo la conta è correlata con la percentuale totale di anomalie cromosomiche. Il 14% degli individui con cariotipo normale avevano un alta percentuale di anomalie cromosomiche degli spermatozoi, questa percentuale è più alta nei pazienti con cariotipo somatico anomalo (36%) e in pazienti con cariotipo meiotico alterato (26%). Nessuna correlazione è stata trovata con l’età.

Conclusioni: la FISH è particolarmente indicata:

1- in individui con normale cariotipo e quando la condizione oligo è presente;

2- in individui con anomalo cariotipo o che sono portatori di polimorfismi eterocromatinici;

3- individui con alterato cariotipo meiotico.

Lo studio dei cromosomi sessuali (X e Y) e del cromosoma 21 sembra essere sufficiente per identificare un paziente “a rischio” cioè quelli con più alta probabilità di produrre spermatozoi con anomalie cromosomiche.

Significative differenze nelle percentuali di anomalie cromosomiche dovrebbero essere prese in considerazione a prescindere dal valore numerico. Gli individui identificati “a rischio” dovrebbero essere informati circa la disponibilità di tecniche di diagnosi genetica preimpianto e prenatale.




Una relazione tra aneuploidie e arresto della maturazione degli spermatozoi

Il caso. Durante la spermiogenesi gli spermatidi vanno incontro ad una serie di modificazioni nucleari e citoplasmatiche, che porteranno poi alla formazione di spermatozoi maturi. A livello nucleare è importante la sostituzione proteine-protamine dei complessi istonici, ma non si sa con certezza se un difetto di questa transizione è associato ad aneuploidie (assetto cromosomico errato delle cellule).
Lo studio. È uno studio diagnostico pubblicato sulla rivista Fertility and Sterility svolto in diversi laboratori universitari di andrologia negli Stati Uniti. Gli autori hanno altre pubblicazioni in questo campo in riviste del settore.
Quesito dello studio. Lo studio vuole investigare una eventuale correlazione tra transizione istonica e aneuploidie negli spermatozoi.
Metodi. Patients. 7 uomini con oligospermia lieve (concentrazione media spermatozoaria= 14.8 milioni).
Interventions. Sono stati fissati su vetrini 58793 spermatozoi (tra gli 8000 e i 10000 per paziente), colorati con blu di anilina per rilevare la transizione proteine-protamine, poi gli stessi sono stati decolorati con acido acetico e in seguito analizzati tramite FISH usando sonde per i cromosomi X, Y e 17, per rivelarne eventuali aneuploidie.
Comparisons. Gli spermatozoi sono stati suddivisi subito dopo colorazione con blu di anilina in 3 gruppi: uno con leggera colorazione (spermatozoi maturi, con proteine istoniche completamente sostituite da protamine), uno con colorazione intermedia (spermatozoi parzialmente immaturi) ed un altro con colorazione molto forte (spermatozoi severamente immaturi).
Outcomes. Sono state definite le proporzioni dei tre gruppi di spermatozoi e valutate, in seguito, le aneuploidie degli stessi.
Risultati. La percentuale di spermatozoi maturi, parzialmente e severamente immaturi è stata, in media, rispettivamente di 73.1%, 21.8% e 5.0%. L’analisi tramite FISH ha rilevato che la percentuale di aneuploidie dei cromosomi studiati era da 4 a 6 volte superiore (da 3.9 per disomia X a 6.1 per disomia XY) negli spermatozoi con colorazione intermedia (parzialmente immaturi) rispetto a quelli con colorazione leggera (maturi). Negli spermatozoi con colorazione forte non è stato trovato nessun segnale delle sonde per FISH.
Conclusioni. Questi risultati suggeriscono che l’arresto della maturazione negli spermatozoi non è ristretta ad un solo compartimento cellulare. Sono noti in letteratura altri studi che ricercano marcatori di immaturità in una componente spermatozoaria e questo lavoro dà un’altra prova della relazione tra vari parametri maturativi. Il fatto che negli spermatozoi severamente immaturi non si ritrovi il segnale delle sonde per FISH può essere spiegato con un’aumentata frammentazione del DNA dovuta ad un accumulo di radicali dell’ossigeno oppure ad una minore concentrazione di enzimi di riparo del DNA, fenomeni entrambi studiati in altri lavori. Gli step di decondensazione e denaturazione del DNA della FISH aggravano ulteriormente questi danni. Visti questi risultati, è probabile che in uomini che presentano arresto della maturazione degli spermatozoi sia sottostimata la percentuale di aneuploidie spermatozoarie.

lunedì 14 giugno 2010

Identificazione non invasiva della spermatogenesi in pazienti con azoospermia non ostruttiva

Il caso. L’azoospermia non ostruttiva, ossia l’assenza di spermatozoi nell’eiaculato dovuta ad un’alterazione della spermatogenesi, è una condizione che interessa circa il 10% degli uomini infertili. Alcuni di questi, però, hanno comunque un basso numero di spermatozoi nei testicoli che possono essere estratti chirurgicamente e usati per fecondazione in vitro, ma il modo fino ad oggi più sicuro per determinare se c’è spermatogenesi è la biopsia testicolare, sottoponendo a stress e traumi il paziente.
Lo studio. È uno studio diagnostico ex vivo pubblicato sulla rivista Human Reproduction e svolto nel Dipartimento di Urologia dell’Università di San Francisco.
Quesito dello studio. Lo studio vuole ricercare una nuova tecnica non invasiva per determinare la presenza di spermatogenesi nei pazienti azoospermici.
Metodi. Patients. 27 uomini che si sono sottoposti a biopsia testicolare per la valutazione diagnostica di azoospermia o per vasectomia.
Interventions. I tessuti bioptici sono stati analizzati istologicamente e in seguito è stata effettuata una spettroscopia a risonanza magnetica di idrogeno (1H-MRS) dei tessuti per valutarne differenze nel metabolismo.
Comparisons. I pazienti sono stati suddivisi in 3 gruppi dopo analisi istologica: 9 pazienti con spermatogenesi normale, 9 con arresto della maturazione (5 precoce e 4 tarda) e 9 con Sindrome a Sole Cellule del Sertoli (SCOS).
Outcomes. Paragone degli spettri di assorbimento di 19 diversi metaboliti per valutare differenze nelle varie condizioni di spermatogenesi.
Risultati. Di tutti i 19 metaboliti analizzati solo la fosfocolina e la taurina hanno presentato differenze significative ma solo tra i tessuti con spermatogenesi normale e quelli con SCOS, mentre quelli con arresto della maturazione presentavano valori intermedi. Inoltre, è stato visto che il pattern metabolico dei tessuti con arresto tardo della maturazione si avvicinava a quello proprio della spermatogenesi normale, indicando che fosfocolina e taurina possano essere marcatori del livello di spermatogenesi.
Conclusioni. I risultati di questo lavoro danno la base per l’allestimento di tecniche non invasive per valutare la spermatogenesi in pazienti affetti da azoospermia non ostruttiva, eliminando potenzialmente i disagi a cui vanno incontro questi pazienti dopo biopsie. Ulteriori studi sono necessari per la valutazione di questa tecnica in vivo, ma comunque si dimostra che può essere definita una specifica “firma metabolica” per almeno due diverse istologie testicolari (normale e SCOS).

giovedì 10 giugno 2010

TESE-ICSI come strategia per infertilità da microdelezioni del cromosoma Y

Il caso: tra le cause genetiche di infertilità maschile giocano un ruolo importante le microdelezioni del cromosoma Y presenti nel 6%-18% di uomini con azoospermia non ostruttiva o oligozoospermia.
Lo studio: è un case-report effettuato presso un ospedale universitario e pubblicato su Fertility and Sterility.
Quesito dello studio: scopo del lavoro è di descrivere il caso di un uomo con azoospermia dovuta a totale delezione della regione AZFc del cromosoma Y che si sottopone a recupero spermatico mediante microdissezione spermatica testicolare (microTESE) seguita da una iniezione spermatica intracitoplasmatica (ICSI) e di una gravidanza raggiunta con successo.
Metodi: Patient(s): un uomo di 38 anni affetto da azoospermia da completa delezione della regione AZFc del cromosoma Y. Intervention(s): microTESE per il recupero spermatico da tessuto testicolare effettuato lo stesso giorno dell’ICSI. Outcome(s): fertilizzazione e risultato della gravidanza.
Risultati:tre embrioni (su 6 ovociti iniettati) di buona qualità sono stati ottenuti mediante ICSI con spermatozoi testicolari (motili ma non progressivi) recuperati con microTESE e sono stati crioconservati. Dopo trasferimento degli embrioni scongelati è stata diagnosticata una gravidanza trigemina clinica mediante visualizzazione ecografica di 3 sacche gestionali e di 3 battiti fetali alla 7° settimana di gestazione. Nascita di 3 bambini (2 maschi e 1 femmina) dopo parto cesareo.
Conclusioni: è il primo lavoro che mostra una gravidanza raggiunta con successo in una coppia in cui l’uomo è azoospermico e portatore di una microdelezione del cromosoma Y nella regione AZFc. Questa delezione sembra non influenzare la prognosi del recupero spermatico mediante TESE, la fertilizzazione e il tasso di impianto embrionale. Tutti i nati sono risultati in buona salute, sebbene i 2 figli hanno ereditato la stessa anomalia del cromosoma Y.

giovedì 3 giugno 2010

Markers di successo in IVF/ICSI


Il caso: la valutazione e la selezione degli embrioni per il trasferimento uterino o la crioconservazione è essenzialmente basata sulla morfologia, mentre idealmente dovrebbe essere basata sulla integrità dei cromosomi.
Lo studio: è uno studio prospettico effettuato presso un centro di Riproduzione assistita e il dipartimento di ostetricia e ginecologia di un ospedale universitario dell’Ohio, pubblicato su Fertility and Sterility.
Quesito dello studio: scopo del lavoro è di verificare un'eventuale relazione fra i livelli delle specie reattive all’ossigeno (ROS, fattori ossidanti che causano danni cellulari) nei mezzi di coltura embrionali al 3° giorno dopo recupero ovocitario in cicli di fertilizzazione in vitro (IVF) o di iniezione spermatica intracitoplasmatica (ICSI) e la qualità embrionale al 3° o al 5° giorno e percentuale di gravidanza (PR) per pazienti che si sottopongono al trasferimento embrionale al 5° giorno.
Metodi: Patient(s): 92 pazienti (56 IVF e 36 ICSI) per 93 cicli di riproduzione assistita. Intervention(s): i livelli di ROS sono misurati in tutte le piastre di coltura embrionale mediante un metodo chemiluminescente. Comparison(s): lo studio compara i dati demografici fra le pazienti gravide e le non gravide; compara fra queste pazienti tutti i risultati del ciclo (unità di farmaci usati nella stimolazione controllata, estrogeni al 3° giorno, numero di follicoli maturi, numero di ovociti recuperati, grado di fertilizzazione, grado di blastocisti e numero di embrioni trasferiti); correlazione fra ROS e risultati del ciclo e gravidanza clinica. Main Outcome(s): qualità embrionale al 3° e 5° giorno e percentuale di gravidanza.
Risultati:1) non sono riscontrate differenze nei parametri demografici fra le gravide e le non gravide. 2) fra i due gruppi non sono state riscontrate differenze nei risultati del ciclo. 3) i livelli di ROS sono significativamente più bassi nei cicli con gravidanza clinica rispetto ai cicli senza gravidanza clinica.
Conclusioni: aumentati livelli di ROS nei mezzi di coltura embrionali possono avere effetti negativi sui parametri embrionali di sviluppo in vitro, come anche sulle percentuali di gravidanza clinica sia per convenzionale IVF che per ICSI. Un basso tempo di coincubazione dei gameti in IVF come anche l’aggiunta di antiossidanti nei mezzi di coltura, come già visto in sperimentazioni con animali, potrebbero essere applicati clinicamente per migliorare i risultati della riproduzione assistita.

Il successo dell’ICSI in casi di azoospermia ostruttiva.

1.Il caso: L’ azoospermia ostruttiva (OA) è determinata dall’assenza o dall’ostruzione delle vie seminali. Gli individui che soffrono di assenza congenita dei vasi deferenti e quelli che presentano fallimenti nella ricostruzione chirurgica, hanno come unica possibilità di ottenere una gravidanza l’ICSI con recupero chirurgico degli spermatozoi dal testicolo (PESA) o dall’epididimo (MESA).
È presente, però, in letteratura un quadro piuttosto discordante sulla fonte di spermatozoi (testicolari o epididimali) e il successo dell’ICSI in casi di OA. Alcuni lavori riportano un’alta incidenza di danni al DNA e di aborti quando sono usati spermatozoi testicolari, suggerendo che i gameti maschili possano influenzare la capacità di sviluppo embrionale. In altri studi è, invece, riportata un’alta percentuale di fallimento dello sviluppo embrionale dopo ICSI con spermatozoi epididimali rispetto a quella con spermatozoi testicolari.
2. Lo studio: è un case-control, pubblicato su Fertility and Sterility e nato dalla collaborazione di quattro centri accademici di diversi stati. Il primo autore ha diverse pubblicazioni anche su riviste come Fertility e Human Repr.
3. Quesito del lavoro: analizzare il successo dell’ICSI in relazione al sito di recupero spermatico (testicolo o epididimo) e alla causa di azoospermia ostruttiva ,in pazienti con normale spermatogenesi.
4. Importanza dello studio: è uno studio che analizza più di 1,100 cicli di ICSI. La più recente pubblicazione, presente in letteratura, riporta 171 cicli di ICSI per pazienti con OA.
5. Metodi: patient(s): 1,121 uomini con OA che sono stati sottoposti a recupero chirurgico degli spermatozoi per ICSI nel periodo compreso tra 1994-2006. E’ stato fatto un esame preliminare consistente nella valutazione del volume testicolare e nell’analisi ormonale (FSH,LH, T). L’azoospermia è stata diagnosticata dall’assenza di spermatozoi dopo centrifugazione (2000 g per 10’). Età media: 39 anni. Intervention(s): i pazienti sono stati raggruppati a seconda dell’origine degli spermatozoi in: epididimali (n=331) o testicolari (n=790). Essi sono stati classificati ulteriormente in due sottogruppi in relazione alle cause di ostruzione: assenza congenita dei vasi deferenti (CBAVD, n=434), e altre cause di ostruzione (n=687). Outcome(s): percentuale di fecondazione, gravidanza clinica e aborti spontanei.
6. Risultati: su 1,121 pazienti che si sono sottoposti a ICSI,sono stati fatti 790 cicli con spermatozoi testicolari e 331 con spermatozoi epididimali.
Considerando l’origine spermatica, nei due gruppi non ci sono differenze significative nella percentuale di fecondazione (68% per spermatozoi testicolari e 64% per quelli epididimali), percentuale di impianto (19.93% spermatozoi testicolari e 20.77% spermatozoi epididimali), percentuale di gravidanza clinica/ciclo (43%spermatozoi testicolari e 42% spermatozoi epididimali), percentule di aborto intorno al 20% per entrambi. Percentuale di fecondazione, di gravidanza clinica e di aborto sono simili anche nei pazienti con CBAVD e in quelli con altre cause di ostruzione.
Conclusioni: La fonte di spermatozoi usati per ICSI in casi di azoospermia ostruttiva e la causa dell’ostruzione non influenzano in termini di percentuale di fecondazione, gravidanza e aborto.